KIT ELISA RNA a doppia catena (dsRNA).

Stu kit hè un test immunosorbente enzimaticu (ELISA) in accoppiamentu cù u sistema biotina-streptavidina, per a misurazione quantitativa di dsRNA cù una lunghezza sopra 60 coppie di basi (bp), indipendentemente da a sequenza.A piastra hè stata pre-coated cun anticorpu anti-dsRNA.dsRNA presente in a mostra hè aghjuntu è si unisce à l'anticorpi rivestiti nantu à i pozzi.È dopu l'anticorpu anti-dsRNA biotinilatu hè aghjuntu è si liga à dsRNA in u sample.Dopu à lavà, HRP-Streptavidin hè aghjuntu è si liga à l'anticorpu anti-dsRNA Biotinilatu.Dopu à l'incubazione, l'HRP-Streptavidina liberata hè lavata.Allora a suluzione di sustrato TMB hè aghjuntu è catalizata da HRP per pruduce un pruduttu di culore blu chì hà cambiatu in giallu dopu l'aghjunzione di a suluzione di stop acidic.A densità di u giallu hè proporzionale à a quantità di destinazione di dsRNA catturata in piastra.L'assorbanza hè misurata à 450 nm.

Applicazione

Stu kit hè per a misurazione quantitativa di dsRNA residuale.

Cumpunenti di u kit

Storage è Stabilità

1. Per u kit inutilizatu: U kit tutale puderia esse guardatu à 2 ~ 8 ℃ in a vita di conservazione.A luce forte deve esse evitata per a stabilità di almacenamiento.

2. Per u kit utilizatu: Una volta chì u microplate hè apertu, copre i pozzi inutilizati cù un sigillatore di piastra è torna in a sacca di fogliu chì cuntene u pacchettu di dessicante, sigillate a borsa di foglia è torna à 2 ~ 8 ℃ u più prestu pussibule dopu l'usu.L'altri reagenti devenu esse tornati à 2 ~ 8 ℃ u più prestu pussibule dopu l'usu.

Materiali necessarii ma micca furniti

1. Lettore Microplate cù filtru 450±10nm (megliu si pò detect à 450 è 650 nm di lunghezza d'onda).

2. Microplate shaker.

3. Tips RNase-free è tubi centrifuge.

Diagramma di flussu di l'operazione

Prima di principià

1. Purtate tutti i cumpunenti di u kit è i campioni à a temperatura di l'ambienti (18-25 ℃) prima di l'usu.Se u kit ùn serà micca usatu in una sola volta, per piacè pigliate solu strisce è reagenti per l'esperimentu attuale, è lasciate e strisce è reagenti rimanenti in cundizione necessaria.

2. Lavà buffer: dilute 40mL di 20 × buffer di lavatu cuncentratu cù 760mL d'acqua deionizzata o distillata per preparà 800mL di 1 × buffer di lavatu.

3. Standard: spine brevemente o centrifuga a suluzione di stock prima di l'usu.A cuncentrazione di quattru standard furnite hè 5ng/μL.Per i standard UTP è pUTP dsRNA, per piacè diluite a suluzione di stock à 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL cù buffer STE per tracciare a curva standard.Per i standard N1-Me-pUTP dsRNA, per piacè diluite a suluzione di stock à 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL cù buffer STE per tracciare a curva standard.Per u standard 5-OMe-UTP dsRNA, per piacè diluite a suluzione di stock à 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg / μL cù buffer STE per tracciare a curva standard.Ricumandemu chì i standard ponu esse diluiti cum'è i seguenti grafici:

4. Anticorpu di rilevazione biotinilata è suluzione di travagliu HRP-streptavidin: spine brevemente o centrifuga a suluzione di stock prima di l'usu.Dilute à a cuncentrazione di travagliu cù un buffer di diluzione.

5. Substate TMB: aspirate a dosa necessaria di a suluzione cù punte sterilizzate è ùn fate micca a suluzione residuale in u vial di novu.U substate TMB hè sensibile à a luce, ùn espone micca u sustrato TMB à a luce per un bellu pezzu.

Utilizà u protocolu

1. Determina u numeru di strisce necessarii per l'assay.Inserite e strisce in i frames per l'usu.E strisce di piastra restante chì ùn sò micca usate in questu analisi deve esse rimballate in u saccu cù dessicante.Chiudere u saccu strettu per u almacenamentu in frigorifero.

2. Aghjunghjite 100μL ognunu di diluzioni di standard, biancu è campioni in i pozzi appropritati.Coperta cù u piattu sealer.Incubate per 1 ora à a temperatura di l'ambienti cù agitazione à 500 rpm.I campioni devenu esse diluiti cù buffer STE à a cuncentrazione adatta per un esame precisu.

3. Passu di lavà: Aspirate a suluzione è lavate cù 250μL buffer di lavà à ogni pozzu è lasciate per 30s.Eliminate completamente u tampone di lavaggio chjappendu a piastra nantu à carta assorbente.Lavà tutale 4 volte.

4. Aghjunghjite 100μL di suluzione di travagliu di l'anticorpu di rilevazione biotinilata in ogni pozzu.Coperta cù u piattu sealer.Incubate per 1 ora à a temperatura di l'ambienti cù agitazione à 500 rpm.

5. Repetite u passu lavatu.

6. Aghjunghjite 100μL di suluzione di travagliu HRP-streptavidin in ogni pozzu.Coperta cù u piattu sealer.Incubate per 30 minuti à a temperatura di l'ambienti cù agitazione à 500 rpm.

7. Repetite u passu lavatu novu.

8. Aghjunghjite 100μL di suluzione di sustrato TMB in ogni pozzu.Coperta cù u piattu sealer.Incubare per 30 min à RT Protegge da a luce.U liquidu diventerà blu da l'aghjunzione di suluzione di sustrato.

9. Aghjunghjite 50μL di suluzione stop in ogni pozzu.U liquidu diventerà giallu cù l'aghjunzione di suluzione stop.Allora eseguite u lettore di microplate è fate a misurazione à 450nm immediatamente.

Calculu di i risultati

1. Medià e letture duplicate per ogni standard, cuntrollu è campioni è sottrae a densità ottica standard zero media.Custruisce una curva standard cù l'assorbanza nantu à l'assi verticale (Y) è a cuncentrazione di dsRNA nantu à l'assi horizontale (X).

2. Hè ricumandemu per fà u calculu cù un software di curve-fitting basatu in computer, cum'è curve expert 1.3 o ELISA Calc in un mudellu di 5 o 4 paràmetri non-linear fit.

Prestazione

1. Sensibilità:

limite inferiore di rilevazione: ≤ 0,001 pg/μL (per UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (per 5-OMe-UTP-dsRNA).

limite inferiore di quantificazione: 0,0156 pg/μL (per UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (per N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (per 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precisione: CV di Intra-Assay ≤10%, CV di Inter-Assay ≤10%

3. Recuperazione: 80% ~ 120%

4.Linearity: 0.0156-0.5pg/μL (forUTP-, pUTP-dsRNA) 0.0312-1pg/μL (forN1-Me-pUTP dsRNA), 0.0625-1pg/μL (per 5-OMe-UTP-dsRNA).

Considerazioni

1. Temperature di reazzione TMB è u tempu hè criticu, per piacè cuntrullà elli secondu l'istruzzioni strettamente.

2. Per ottene una bona riproducibilità di l'assay è a sensibilità, u lavatu propiu di i platti per caccià l'excedente di reagenti senza reazione hè essenziale.

3. Tutti i reagenti sò mischiati bè prima di l'usu è evitendu bumbles durante l'addizione di campioni o reagenti.

4. Se i cristalli sò furmati in u buffer di lavatu cuncintratu (20x), caldu à 37 ℃ è mischjà delicatamente finu à chì i cristalli sò completamente dissoluti.

5. Evite l'assay di mostri chì cuntenenu Sodium Azide (NaN3), perchè puderia distrughjini l'attività HRP risultatu in sottustimazione di a quantità di dsRNA.

6. Evite a contaminazione di RNase durante l'assay.

7. U standard / campione, l'anticorpu di deteczione è u SA-HRP pò ancu esse realizatu à RT senza scuzzulate, ma questu pò causà a sensibilità di deteczione diminuite da una volta.Per questu casu, ricumandemu i standard UTP è pUTP dsRNA deve esse diluitu da 2pg / μL, i standard N1-Me-pUTP dsRNA deve esse diluitu da 4pg / μL è u standard 5-OMe-UTP dsRNA deve esse diluitu da 8pg / μL.Inoltre, incubate a suluzione di travagliu HRP-streptavidina per 60 minuti à a temperatura di l'ambienti.Ùn aduprate micca u flask shaker, perchè u flask shaker pò esse risultatu in un risultatu imprecisu.

Risultu tipicu

1. Dati curve standard

2. Càlculu curva standard

3. Gamma di rilevazione di Liner: 0.0312- 1pg/μL