mRNA Cap2'-O-metiltransferasi

mRNA Cap 2' -O-methyltransferase hè stata derivata da una ceppa di E. coli recombinante chì porta u genu per l'mRNA di vaccinia Cap 2'-O-Methyltransferase.Questa enzima aghjusta un gruppu metile in a pusizione 2'-O di u primu nucleotide adiacente à a struttura di u cappucciu à l'estremità 5 di l'RNA. L'enzima utilizza S-adenosylmethionine (SAM) cum'è un donatore di metile per metilate l'RNA capped (cap. -0) risultatu in una struttura cap- 1.

A struttura Cap1 pò aumentà l'efficienza di a traduzzione, migliurà l'espressione di mRNA in esperimenti di trasfezzione è microinjections.This enzyme specificamente precisa RNA cù un capu m7GpppN cum'è sustrato.Ùn pò micca aduprà RNA cù pN, ppN, pppN o GpppN à l'estremità 5'.L'ARN capped pò esse preparatu per trascrizzione in vitro cù l'analogicu di cappucciu o per capping enzymatic usendu l'enzyme capping Vaccinia.

Cumpunenti

mRNA Cap 2'-O-metiltransferasi (50U/μL)

10 × Capping Reaction Buffer

Storage

-25 ～- 15 ℃ per u almacenamentu （ Evite cicli ripetuti di congelazione-discongelu）

Buffer di almacenamentu

20 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glicerol.

Definizione di unità

Una unità hè definita cum'è a quantità di enzima necessaria per methylate 10 pmoles di 80 nt capped RNA transcript in 1 hour à 37 ° C.

Testi di cuntrollu di qualità

Esonucleasi: 50U di mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase cù 1μg λ-Hind III digest DNA à 37 ℃ per 16 ore ùn produce alcuna degradazione cum'è determinatu da l'elettroforesi di gel d'agarose.

Endonuclease: 50 U di mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase cù 1 μg λDNA à 37 ℃ per 16 ore ùn produce micca degradazione cum'è determinatu da elettroforesi di gel d'agarose.

Nickase: 50U di mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase cù 1μg pBR322 à 37 ℃ per 16 ore ùn produce micca degradazione cum'è determinata da l'elettroforesi di gel d'agarose.

RNase: 50U di mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase cù 1.6μg MS2 RNA per 4 ore à 37 ℃ ùn produce alcuna degradazione cum'è determinata da l'elettroforesi di gel di agarose.

E. coli DNA: 50U di mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase è sottoposto a screening per la presenza diE. coli DNA genomicu utilizendu TaqMan qPCR cù primers specifichi per uE. coli locus rRNA 16S.UE. coli A contaminazione di DNA genomicu hè = 1E. coli genoma.

Battèrica Endotossina: LAL-test, secondu a Farmacopea Cinese IV edizione 2020, u metudu di test limite di gel, regula generale (1143).U cuntenutu di l'endotossina bacteriana deve esse = 10 EU/mg.

Sistema di reazione è cundizioni

1. Unisce una quantità approprita di RNA Capped è RNase-free H2O in un tubu di microcentru da 1,5 mL à un voluminu finali di 16,0 µL.

2. Calore à 65 ℃ per 5 minuti seguita da un bagnu di ghiaccio per 5 minuti.

3. Aghjunghjite i seguenti cumpunenti in l'ordine specificatu (per methylation di Capped RNA

menu di 10

*10× Tampone di Reazione di Capatura: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Incubate à 37 ℃ per 1 ora (2 ore d'incubazione hè cunsigliatu per u fragmentu di destinazione menu di 200 nt).

Applicazioni

Per migliurà l'espressione di mRNA durante l'esperimenti di microiniezione è trasfezione.

Note nantu à l'usu

1. Prima di a reazione, l'RNA deve esse purificatu è dissolutu in acqua senza nuclease, tutte e suluzione ùn deve micca cuntene EDTA è ioni.

2. Hè ricumandemu di riscalda l'RNA di mostra à 65 ℃ per 5 min prima di a reazione per sguassà a struttura secundaria in u 5'end di a trascrizione.Puderia esse allargatu à 10 min per una struttura cumplessa di 5 '-terminale.