PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F) hè u metudu enzimaticu più efficace per sguassà quasi tutti l'oligosaccharidi N-ligati da glicoproteini.PNGase F hè una amidasi, chì scinde trà i residui più interni di GlcNAc è asparagine di oligosaccaridi high mannose, hibridi è cumplessi da glicoproteini N-ligati.
Applicazione
Questa enzima hè utile per a rimuzione di residui di carbuidrati da e proteine.
Preparazione è specificazione
| Apparizione | Liquidu incolore |
| Purezza di a proteina | ≥95% (da SDS-PAGE) |
| Attività | ≥500.000 U/mL |
| Exoglycosidase | Nisuna attività puderia esse rilevata (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglicosidasi F2 | ND |
| Endoglicosidasi F3 | ND |
| L'endoglicosidasi H | ND |
| Proteasi | ND |
Pruprietà
| numeru EC | 3.5.1.52(Recombinante da u microorganismu) |
| Pesu moleculare | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Puntu isoelettricu | 8. 14 |
| pH ottimale | 7,0-8,0 |
| Temperature ottimali | 65 °C |
| Specificità di u substratu | Cleaving glycosidic bonds between GlcNAc and asparagine residues Fig.1 |
| Siti di ricunniscenza | Glycani N-ligati, salvu chì cuntenenu α1-3 fucose Fig. 2 |
| Attivatori | DTT |
| Inibitore | SDS |
| Temperature di almacenamiento | -25 ~ -15 ℃ |
| Inattivazione di u calore | Una miscela di reazione da 20 µL contenente 1 µL di PNGase F viene inattivata da incubazione a 75 °C per 10 minuti. |
Fig. 1 Specificità di u substratu di PNGase F
Fig. 2 Siti di ricunniscenza di PNGase F.
Quandu i residui interni di GlcNAc sò ligati à l'α1-3 fucose, PNGase F ùn pò micca scindere l'oligosaccharidi N-linkati da i glicoproteini.Questa mudificazione hè cumuna in i pianti è certi glicoproteini d'insetti.
Coponenti
|
| Cumpunenti | Cuncentrazione |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10 × Glycoprotein Denaturating Buffer | 1000 µl |
| 3 | 10 × GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Definizione di unità
Una unità (U) hè definita cum'è a quantità di enzima necessaria per rimuovere > 95% di carbuidrati da 10 µg di RNase B denaturata in 1 ora à 37 ° C in un volume di reazione totale di 10 µL.
Cundizioni di reazione
1.Dissolve 1-20 µg di glicoproteina cù acqua deionizzata, aghjunghje 1 µl 10×Glycoprotein Denaturating Buffer è H2O (se necessariu) per fà un volume di reazione tutale di 10 µl.
2.Incubate à 100 ° C per 10 min, rinfriscà nantu à u ghjacciu.
3.Ajouter 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 et mélanger.
4.Aggiungere 1-2 µl PNGasi F e H2O (se necessariu) per fà un volume di reazione tutale di 20 µl è mischjà.
5.Incubate a reazione à 37 ° C per 60 min.
6.Per analisi SDS-PAGE o analisi HPLC.
