Vaccinia Virus Capping Enzyme

L'enzyme capping di u virus Vaccinia hè derivata da una ceppa recombinante di E. coli porta i geni per l'enzyme capping Vaccinia.Questa sola enzima hè composta da duie subunità (D1 è D12) è hà trè attività enzimatici (RNA trifosfatasi è guanililtransferasi da a subunità D1 è guanine metiltransferasi da a subunità D12).Vaccinia virus Capping Enzyme hè efficace per catalizà a furmazione di struttura di cappucciu, chì pò specificamente attaccate a struttura di cappucciu 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) à l'estremità 5' di RNA.A struttura di Cap (Cap 0) ghjoca un rolu impurtante in a stabilizazione di mRNA, u trasportu è a traduzzione in eucarioti.Capping RNA per reazione enzimatica hè un metudu efficace è simplice chì pò migliurà significativamente a stabilità è a traduzzione di l'RNA per a trascrizione in vitro, trasfezzione è microinjection.

Cumpunenti

Enzyme de capsulage du virus de la vaccine (10 U/μL)

10 × Capping Buffer

Cundizioni di almacenamiento

-25～- 15 ℃ per u almacenamentu （ Evite cicli ripetuti di congelazione-discongelu）

Buffer di almacenamentu

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol.

Definizione di unità

Una unità di Vaccinia virus Capping Enzyme hè definitu cum'è a quantità di enzima necessaria per incorpore 10pmol di GTP in una trascrizione 80nt in 1 ora à 37 ° C.

Controlu di qualità

Esonucleasi:10U di Vaccinia virus Capping Enzyme con 1μg di DNA digerente λ-Hind III a 37 ℃ per 16 ore non produce degradazione come determinato da elettroforesi su gel d'agarosio.

Endonucleasi:10U di Vaccinia virus Capping Enzyme con 1μg λDNA a 37℃ per 16 ore non produce degradazione come determinato da elettroforesi su gel d'agarosio.

Nickase:10U di Vaccinia virus Capping Enzyme cù 1 μg pBR322 à 37 ℃ per 16 ore ùn produce alcuna degradazione cum'è determinata da l'elettroforesi di gel d'agarose.

RNase:10U di Vaccinia virus Capping Enzyme cù 1.6μg MS2 RNA per 4 ore à 37 ℃ ùn produce alcuna degradazione cum'è determinata da l'elettroforesi di gel d'agarose.

1.coli DNA:10U di Vaccinia virus Capping Enzyme hè screened per a presenza di E. coli genomic DNA utilizendu TaqMan qPCR cù primers specifichi per u locus rRNA E. coli 16S.A contaminazione di l'ADN genomicu di E. coli hè ≤1 genomu di E. coli.

2.Battèrica Endotossina: LAL-test, secondu a Farmacopea Cinese IV edizione 2020, u metudu di test limite di gel, regula generale (1143).U cuntenutu di l'endotossina bacteriana deve esse ≤10 EU/mg.

Sistema di reazione è cundizioni

1. Capping Protocol (volume di reazione: 20 μL)

Questa prucedura hè applicabile à a reazione di capping di 10μg RNA (≥100 nt) è pò esse scalata secondu e richieste sperimentali.

I) Combina 10 μg di RNA e H2O senza nucleasi in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml per ottenere un volume finale di 15,0 μL.*10×Tampon di tappatura: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Scaldate à 65 ℃ per 5 minuti seguita da un bagnu di ghiaccio per 5 minuti.

3) Aghjunghjite i seguenti cumpunenti in l'ordine specificatu

*10×Tampon di tappatura: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

4) Incubate à 37 ° C per 30 minuti, l'RNA hè avà tappatu è pronto per l'applicazioni downstream.

2. 5′ terminal reazione di etichettatura (volume di reazione: 20 μl)

Stu protokollu hè pensatu per etichettate RNA chì cuntene un trifosfatu 5' è pò esse scalatu secondu e richieste.L'efficienza di l'incorporazione di l'etichetta serà affettata da u rapportu molare di RNA: GTP, è ancu da u cuntenutu di GTP in campioni di RNA.

1) Unisce a quantità adatta di RNA è H2O senza nucleasi in un tubu di microcentrifuga da 1,5 ml à un volume finale di 14,0 µL.

2) Scaldate à 65 ℃ per 5 minuti seguita da un bagnu di ghiaccio per 5 minuti.

3) Aghjunghjite i seguenti cumpunenti in l'ordine specificatu.

** GTP MIX si riferisce à GTP è un picculu numeru di marcatori.Per a cuncentrazione di GTP, riferiteà a nota 3.

4) Incubare a 37 ° C per 30 minuti, l'estremità RNA 5' è ora etichettata e pronta per a valle

Applicazioni

1. Capping mRNA prima di traduzzione assays / in vitro translation

2. Labelling 5' end of mRNA

Note nantu à l'usu

1.Riscaldamentu di a suluzione di RNA prima di l'incubazione cù l'enzyme di capping Vaccinia elimina a struttura secundaria à l'estremità 5 di a trascrizione.Allargà u tempu à 60 minuti per trascrizioni cun 5'ends altamente strutturati cunnisciuti.

2. L'RNA utilizatu per capping reactions deve esse purificatu prima di l'usu è suspesu in acqua senza nuclease.L'EDTA ùn deve esse presente è a suluzione deve esse libera di sali.

3. Per l'etichettatura di l'estremità 5', a cuncentrazione di GTP tutale deve esse intornu à 1-3 volte a concentrazione molare di mRNA in a reazione.

4. U voluminu di u sistema di reazzione pò esse scaled up o down secondu l'attuale.