5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Cat No: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) hè una mistura altamente stabile basata in sonde in un tubu adattatu per a trascrizione inversa in un passu è a PCR quantitativa (qRT-PCR).Supporta u pre-mixing di primers è sonde è resta stabile dopu un longu tempu di almacenamentu à bassa temperatura.U campionu per esse pruvatu pò esse aghjuntu direttamente à l'usu, senza apertura di tubu supplementu / operazione di pipetting.Stu pruduttu furnisce cumpunenti, per esempiu DNA polimerasi hot-start, M-MLV, uracile DNA glicosilasi termolabile (TS-UNG), RNase Inhibitor, MgCl2, dNTPs (cù dUTP invece di dTTP), è stabilizatori.Cù a transcriptase inversa di amplificazione rapida geneticamente modificata è l'ADN polimerasi, hè pussibule cumprità l'amplificazione PCR in 20-40 minuti.Stu reagentu usa un buffer speciale per qPCR cù enzimi misti di l'enzima di amplificazione anti-inhibitory è l'enzima UNG.Dunque, pò ottene una bona amplificazione di i geni di destinazione è impedisce l'amplificazione falsa causata da a contaminazione residuale di PCR è aerosol.Stu reattivu hè cumpatibile cù a maiò parte di i strumenti PCR quantitativi di fluorescenza da i pruduttori cum'è Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad è Roche.
Cumpunente
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Cundizioni di almacenamiento
Tutti i cumpunenti deve esse mantinuti à -20 ℃ per un almacenamentu longu è 4 ℃ finu à 3 mesi.Per piacè mischjà bè dopu a scongelu è centrifuga prima di aduprà.Evite friquenti-discongeli frequenti.
Preparazione di u Sistema di Reazione qRT-PCR
| Cumpunenti | 25μLSistema | 50μLSistema | Concentrazione finale |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 μL | 10 μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1 μL | 2 μL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mixa | 1 μL | 2 μL | 1× |
| Template RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Finu à 25 μL | Finu à 50 μL | – |
1) a.A cuncintrazione finali di primer hè di solitu 0.2μM.Per megliu risultati, a cuncentrazione di primer pò esse ottimizzata in a gamma di 0.2-1μM.In generale, a cuncentrazione di a sonda pò esse ottimizzata in a gamma di 0.1-0.3μM.
2) b.When aduprate una Procedura di PCR veloce, l'aumentu di a cuncentrazione di primers è sonde pò esse risultatu in risultati di amplificazione megliu, è u so rapportu deve esse ottimizatu in cunseguenza.
3) Diversi tipi di campioni cuntenenu diversi tipi è cuntenutu di l'inibitore è u numeru di copia di u genu di destinazione.U voluminu di mostra deve esse cunsideratu da a cundizione attuale.Fate una diluzione di a mostra cù acqua senza nucleasi o TE Buffer, se ne necessariu.
Reazione Ccundizzioni
| Procedura PCR Regular | Procedura PCR rapida | ||||||
| Prucedura | Temp. | U tempu | Ciclu | Prucedura | Temp. | U tempu | Ciclu |
| Trascrizione inversa | 50 ℃ | 10-20 minuti | 1 | Trascrizione inversa | 50 ℃ | 5 minuti | 1 |
| Polimerasi Attivazione | 95 ℃ | 1-5 minuti | 1 | Polimerasi Attivazione | 95 ℃ | 30s | 1 |
| Denaturazione | 95 ℃ | 10-20 s | 40-50 | Denaturazione | 95 ℃ | 1-3 s | 40-50 |
| Ricottura è Estensione | 56-64 ℃ | 20-60 anni | Ricottura è Estensione | 56-64 ℃ | 3-20 s | ||
Controlu di qualità
1.Rilevazione di funzioni: sensibilità, specificità è ripetibilità di qPCR.
2.Nisuna attività di nucleasi esogena: senza endonucleasi esogenu è contaminazione di esonucleasi.
Notes
1.A rata di amplificazione di a DNA polimerasi rapida ùn hè micca menu di 1 kb / 10s.Diversi strumenti PCR anu diverse velocità di riscaldamentu è raffreddamentu, modi di cuntrollu di temperatura è conducibilità termale, è cusì l'ottimisazione di a vostra cuncentrazione di primer / sonda è u metudu di esecuzione in cumminazione cù u vostru strumentu specificu di PCR veloce hè essenziale.
2.Stu pruduttu faci una larga applicabilità, è hè adattatu per u diagnosticu moleculare d'alta sensibilità.U metudu di PCR in trè fasi hè cunsigliatu per primers cù bassa temperatura di annealing o per l'amplificazione di frammenti lunghi più di 200 bp.
3.Siccomu i diversi ampliconi anu una efficienza d'utilizazione diversa di dUTP è una sensibilità diversa à UNG, i reagenti devenu esse ottimizzati se a sensibilità di rilevazione diminuisce quandu si usa u sistema UNG.Per piacè cuntattateci per supportu tecnicu se necessariu.
4.Per evità l'amplificazione di i prudutti di PCR di riportu, l'area sperimentale dedicata è a pipetta sò necessarie per l'amplificazione.Operate cù guanti è cambiate spessu è ùn apre u tubu PCR dopu l'amplificazione.
