Mini kit di estrazione di DNA
Stu kit adotta un sistema di buffer ottimizzato è una tecnulugia di purificazione di colonna di gel di silice, chì pò ricuperà frammenti di DNA 70 bp - 20 kb da diverse concentrazioni di gel d'agarosi TAE o TBE.A colonna di adsorzione di DNA pò adsorbe l'ADN in particulare in cundizioni di alta salina.Inoltre, u kit pò purificà direttamente i frammenti di DNA da i prudutti PCR, sistemi di reazzione enzimatica o prudutti di DNA crudo ottenuti da altri metudi, è sguassà impurità cum'è proteine , altri composti organici, ioni di sali inorganici è primers oligonucleotide.Pò assicurà chì a purificazione pò esse cumpletata in 10-15min.L'ADN purificatu pò esse usatu direttamente per a ligazione, trasfurmazioni, digestione enzimatica, trascrizione in vitro, PCR, sequencing, microinjection, etc.
Cundizioni di almacenamiento
Mantene à -15 ~ -25 ℃ è trasportu à a temperatura di l'ambienti.
Cumpunenti
| Cumpunenti | (100 rxns) |
| Buffer PIB | 80 ml |
| Buffer GW | 2 × 20 ml |
| Tampon d'eluzione | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
PIB tampon:tampone di legame di DNA.
Buffer GW:tampone per lavà;aghjunghje etanolu assolutu da u voluminu indicatu nantu à a buttiglia prima di l'usu.
Tampone d'eluzione:Eluzione.
FastPure DNA Mini Columns-G:Colonne di adsorbimentu di DNA.
Tubi di raccolta 2 ml:Tubi di raccolta per filtrati.
Materiali preparati
Tubi sterilizzati da 1,5 ml, etanolu assolutu è isopropanol (quandu u fragmentu di DNA ≤100 bp, aghjunghje 1 volume).
isopropanol à 1 volume gel), bagnu d'acqua.
Prucessu di esperimentu
Aghjunghjite 80 ml di etanolu per diluire Buffer GW cum'è indicatu nantu à l'etichetta prima di l'usu, guardate à a temperatura di l'ambienti.
Meccanismu
1. Soluzione di reazione PCR
Schema di estrazione di gel: Aggiungi uguale volume Buffer GDP Schema di ricuperazione di soluzione di reazione PCR:Add 5 volte u voluminu Buffer
2. PIB Calcule u voluminu di gel (100 μl hè uguale à 100 mg)
Dissolve u gel
3. Preheat à 50 ~ 55℃
4. Bind Wash
Aggiungere 300 μL di Buffer GDP*
Aggiungere 700 μL di Buffer GW
Aggiungere 700 μL di Buffer GW
5. Elute
Aggiungere 20 - 30 μL di Elution Buffer o acqua deionizzata
Notes* Recuperazione di fluidu di reazione PCR senza stu passu
U prugramma di estrazione di gel
1. Dopu à l'elettroforesi di l'ADN per fraccionà i frammenti di DNA, escise a sola striscia di fragmentu di DNA da u gel d'agarose sottu u lume UV.Hè ricumandemu d'utilizà carta assorbente per assorbe l'umidità apparente di u gelu è minimizzà a dimensione di a fetta di gel eliminendu l'agarose extra quant'è pussibule.Pesa a fetta di gel (senza tubu di microcentrifuga) per calculà u so voluminu: U voluminu di 100 mg gelslice hè di circa 100 μL, assumendu chì a densità hè 1g/ml.
2. Add ugguali volume Buffer GDP, incubate à 50 ~ 55 ℃ per 7-10 min (sicondu a dimensione di gel, aghjustate u tempu d'incubazione finu à chì u gel hè dissolutu).Inverte u tubu 2 volte durante l'incubazione.
Δ L'aggiunta di 1-3 volumi di Buffer GDP ùn influenzerà micca l'efficienza di ricuperazione di DNA.Se u fragmentu di DNA da ricuperà <100 bp, 3 volumi di Buffer GDP deve esse aghjuntu;quandu a fetta di gel hè dissoluta cumplitamenti, aghjunghje 1 volume di isopropanol è mischjà bè, poi cuntinuà à u passu prossimu.
3. Centrifugare brevemente per portà a mostra à u fondu di u tubu, inserisce u FastPure DNA Mini Columns-G in i Tubi Collection 2 ml, trasferisce cù cura a suluzione massima di 700 μL una volta à
tempu à e colonne di filtrazione, centrifuga à 12.000 rpm (13.800 X g) per 30-60 sec.
4. Scacciate u filtratu è aghjunghje 300 μL di Buffer GDP à a colonna, incubate à a temperatura di l'ambienti per 1 min, centrifuge à 12,000 rpm (13,800 X g) per 30-60 sec.
5. Scacciate u filtratu è aghjunghje 700 μL di Buffer GW (verificate se l'etanol assolutu hè statu aghjuntu in anticipu!) À a colonna, centrifuga à 12 000 rpm (13 800 X g) per 30-60 sec.
Δ Per piacè aghjunghje Buffer GW intornu à u muru di a colonna d'adsorption, o aghjunghje a copertina posteriore di Buffer GW è mischjà a testa in giù per 2 - 3 volte per aiutà à lavà completamente u salinu aderente à u muru di u tubu.
6. Repetite u passu 5.
Δ Flushing cù Buffer GW duie volte pò assicurà chì u sali hè completamente eliminatu è eliminà l'impattu in esperimenti successivi.
7. Scacciate u filtratu è centrifuga a colonna vacante à 12 000 rpm (13 800 X g) per 2 min.
8. Inserite a colonna in un tubu di microcentrifuge pulito da 1,5 ml, aghjunghje 20 - 30 μL di Elution Buffer à u centru di a membrana di a colonna, incubate per 2 min, è poi centrifuge à 12.000 rpm (13.800 X g) per 1 min.Scacciate a colonna, guardate l'ADN ottenutu à -20.
Δ Trasferendu u supernatante di u passu 8 à a colonna per eluzione di novu è preriscaldamentu di l'Elution Buffer à 55 (quandu u fragmentu di DNA> 3 kb) pò esse utile per aumentà l'efficienza di ricuperazione.
Programma di ricuperazione di i prudutti PCR
Stu protokollu hè applicabile per purificà i frammenti di DNA da i prudutti PCR, u sistema di reazione enzimatica è altri prudutti di DNA crudo (cumpresu DNA geneticu).Sta suluzione pò sguassà in modu efficiente diversi nucleotidi, primers, primer dimers, molécules di sali, enzimi è altre impurità.
1. Centrifuga brevemente i prudutti di PCR, suluzione di reazzione enzimatica, è altri prudutti di DNA crudo.Estimate u so voluminu cù pipette è trasfiriu à un tubu sterilizatu di 1,5 ml o 2 ml.Aghjunghjite ddH2O finu à u voluminu finu à 100 μL;mentre chì per l'ADN genomicu cun alta cuncentrazione, diluting à 300 μL cù ddH2O aiutarà à migliurà l'efficienza di ricuperazione.
2. Add 5 volumi di Buffer GDP, mischjà bè invertendu o vortexing.Se u fragmentu di DNA d'interessu> 100 bp, 1,5 volumi supplementari (campioni + Buffer GDP) di etanolu deve esse aghjuntu.
3. Inserisce a colonna torna in u tubu di cullizzioni, trasfiriu u mischju à a colonna, centrifuga à 12 000 rpm (13 800 × g) per 30 - 60 sec.Se u voluminu di a suluzione mista hè > 700 µL, rimette a colonna di adsorption in u tubu di cullezzione, trasferisce a suluzione restante à a colonna di adsorption, è centrifuga à 12.000 rpm (13.800 × g) per 30 - 60 sec.
4. U prossimu spettaculu si riferisce à u passu 5 - 8 di u prugramma di estrazione 08- 1/Gel.
Applicazioni
Diverse concentrazioni di TAE o TBE agarose gel;Prodotti PCR, sistemi di reazzione enzimatica o altri prudutti di DNA crudo ottenuti da diversi metudi.I frammenti recuperati varianu da70 bp - 20 kb.
Notes
Solu per usu di ricerca.Ùn hè micca usatu in i prucessi di diagnostichi.
1. Aghjunghjite 80 ml di etanol à dilute Buffer GW cum'è indicatu nantu à l'etichetta prima di l'usu, guardate à a temperatura di l'ambienti.
2. Sè u Buffer GDP hè facile à precipitate durante u almacenamentu di bassu-temperature, pò esse piazzatu à a temperatura di l'ambienti per un periudu di tempu prima di usu.In casu di necessariu, pò esse preriscaldatu in un bagnu d'acqua di 37 ℃ finu à chì u precipitatu hè dissolutu cumplettamente, è poi pò esse usatu dopu à mischjà.
3. Pone a temperatura di u bagnu d'acqua à 50 ~ 55 ℃ in anticipu.
4. In u passu 1 di u prugramma di estrazione di 08-1 / Gel, minimizendu a dimensione di a fetta di gel riducerà significativamente u tempu di dissoluzione è aumenta l'efficienza di ricuperazione (l'ADN linearizatu hè facilmente idrolizatu quandu espunutu continuamente à alta temperatura).Ùn espone micca u gel di DNA à i raggi UV per un bellu pezzu, postu chì a luce ultravioletta pò causà danni à l'ADN.
5. Dissolve u gel in 08- 1/Gel extracture program step 2 cumplitamenti, altrimenti l'efficienza di ricuperazione di DNA serà seriamente affettata.
6. Preheat Elution Buffer o ddH2O à 55 ℃, chì hè utile per migliurà l'efficienza di l'eluzione di DNA.Si consiglia di conservare il DNA in un eluente di Tris-HCl 2,5 mM, pH 7,0 – 8,5.
