EndoFree Plasmid Maxi Kit
Stu kit hè adattatu per l'estrazione da 150 - 300 ml di suluzione bacteriana cultivata durante a notte, utilizendu un metudu SDS-alkaline lysis per lisi i batteri.L'estrattu crudu hè cumminatu selettivamente cù un Endotoxin Scavenger unicu è separatu per centrifugazione per caccià l'endotossine.Allora, a membrana di gel di silice si ligami selettivamente à l'ADN plasmidicu in a suluzione in cundizioni di sali altu è pH bassu.Questu hè seguitatu da l'aghjunzione di tampone di lavatu per sguassà impurità è altri cumpunenti batterichi.Infine, un tampone d'eluzione à pocu sali è altu pH hè utilizatu per eluisce l'ADN plasmidicu puru da a membrana di a matrice di silicium.A membrana di gel di silice impiega una membrana di adsorzione speciale, è a differenza di quantità di adsorzione trà a colonna è a colonna hè assai chjuca è a ripetibilità hè bona.Fenol, cloroformu è altri reagenti tossichi ùn sò micca richiesti, è nè passi di precipitazione di etanolu.Stu kit pò ièssiri usatu pi extracte rapidamenti 0,2 -1,5 mg di DNA plasmidi puri high-copia, cù una rata d'estrazzioni di 80% -90%.U kit usa una formula di prucessu unica chì elimina l'endotossina, u cuntenutu di l'endotossina hè estremamente bassu è l'effettu di trasfezzione cellulare hè eccellente.U plasmide estratto pò esse direttamente utilizatu in a digestione enzimatica, a PCR, a trascrizione in vitro, a trasfurmazioni, a sequenza è altri esperimenti di biologia moleculare.
Cundizioni di almacenamiento
RNaseA deve esse almacenatu à -30 ~ -15 ℃ è trasportatu à ≤0 ℃.
Endotoxin Scavenger pò esse almacenatu à 2 ~ 8 ℃ per un mese, almacenatu à -30 ~ -15 ℃ per un almacenamentu longu.è trasportatu à ≤0℃.
L'altri cumpunenti deve esse guardatu à a temperatura di l'ambienti (15 ~ 25 ℃) è trasportati à a temperatura di l'ambienti.
Cumpunenti
| Cumpunenti | 10RXNS |
| RNase A | 750 μl |
| tampon P1 | 75 ml |
| tampon P2 | 75 ml |
| Buffer P4 | 75 ml |
| Scavenger di Endotoxin | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Tampon TB | 20 ml |
| Maxi colonne FastPure DNA (ognuna in un tubu di raccolta da 50 ml) | 10 |
| Tubu di raccolta senza endotossine | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, usatu per sguassà RNA.
tampon P1:tampone di sospensione bacteriana, aghjunghje RNaseA à Buffer P1 prima di u primu usu.
tampon P2:tampone di lisi batterica (contene SDS/NaOH).
tampon P4:tampone neutralizzante.
Endotoxin Scavenger:elimina in modu efficace l'endotossina da l'estratto di plasmidi crudo.
Buffer PW:tampone di lavà, aghjunghje u voluminu stipulatu di etanol prima di u primu usu.
Tampon TB:tampon d'elution.
Colonne FastPure DNA Maxi:colonne di adsorbimentu di DNA plasmidicu.
Tubi di raccolta 50 ml:tubi di raccolta di filtrati.
Tubu di raccolta senza endotossine:tubi di raccolta di DNA plasmidico.
Materiali preparati
Etanolo assoluto, isopropanolo, provette da centrifuga a fondo tondo da 50 ml e senza endotossine da 50 mltubi da centrifuga.
Applicazioni
Stu pruduttu hè adattatu per l'estrazione à grande scala di plasmidi da 150 - 300 ml di suluzione bacteriana.cultivatu durante a notte.
Prucessu di esperimentu
1. Pigliate 150 - 200 ml (micca più di 300 ml) di suluzione bacteriana cultivata durante a notte è centrifuga àcirca 11.000 rpm (12.000 × g) per 1 - 2 min.Scacciate u supernatant è raccoglie i batteri.
Δ Quandu si raccoglie più di 50 ml di suluzione bacteriana, i battìri ponu esse raccolti aghjunghjendu a suluzione bacteriana, centrifugazione, scartà u supernatant è altri passi in u stessu tubu di 50 ml per
parechje volte.
2. Aghjunghjite 7,5 ml di Buffer P1 (per piacè verificate se RNaseA hè statu aghjuntu à Buffer P1) à a centrifuga.un tubu chì cuntene batteri è mischjà bè cù vortex o pipetta.
Δ A risuspensione cumpleta di battìri in questu passu hè critica per u rendiment, è ùn deve esse micca clumps bacterial dopu a risuspensione.Se ci sò clumps bacterial chì ùn sò micca mischiati bè, affettaranu a lisi, risultatu in un rendimentu bassu è purità.Se l'OD600 di a suluzione bacteriana hè 0,65, hè ricumandemu chì 7,5 ml di Buffer P1 sia utilizatu per esse estratti da 150 ml di suluzione bacteriana;quandu OD600 hè 0,75, 8 ml di Buffer P1 deve esse usatu è i volumi di Buffers P2 è P4 deve esse cambiatu in cunseguenza.Se u voluminu di a suluzione bacteriana hè aumentatu à 200 ml, hè cunsigliatu chì uvolume di Buffers P1, P2, è P4 esse aumentatu proporzionalmente.
3. Aghjunghjite 7,5 ml di Buffer P2 à a sospensjoni bacteriana da u passu 2 è mischjà delicatamente per 6 - 8.volte è incubate à a temperatura di l'ambienti per 4 - 5 min.
Δ Invertite delicatamente per mischjà bè.Vortexing pruvucarà a frammentazione di l'ADN genomicu, risultatu in frammenti di DNA genomicu in u plasmide estratto.À questu tempu, a suluzione diventa viscosa è trasluzente, chì mostra chì i battìri sò stati completamente lisi.A durata ùn deve esse più di 5 min per evità a distruzzione di i plasmidi.Se a suluzione ùn hè micca chjaru, ci pò esse troppu battìri risultatulisi incompleta, cusì a quantità di bacteria deve esse ridutta in modu adattatu.
4. Aghjunghjite 7,5 ml di Buffer P4 à a sospensjoni bacteriana da u passu 3 è immediatamente invertite delicatamente 6 - 8 volte per permette a suluzione per neutralizà completamente u Buffer P2.À questu tempu, u precipitatu flocculentu biancu deve apparisce.Centrifugare à più di circa 11.000 rpm (12.000 × g) per 10 - 15 min, pipettate cù cura u supernatant in un novu tubu di centrifuga di 50 ml à fondu tondo (auto-preparatu), è evitari.aspire u precipitatu biancu flottante.
Δ Aghjunghjite u Buffer P4 è inverte immediatamente per mischjà bè.Lasciate u tubu per stà finu à chì u precipitatu biancu hè distribuitu uniformemente in tutta a suluzione per prevene a pruduzzione di precipitazione lucale chì puderia influenzà a neutralizazione.Se ùn ci hè micca un precipitatu flocculentu biancu uniforme prima di a centrifugazione è u supernatant ùn hè micca chjaru dopu a centrifugazione, u tubu pò essecentrifugate per altri 5 min.
5. Add 0. 1 volte u voluminu (10% di u voluminu supernatant, circa 2,2 ml) di Endotoxin Scavenger à u supernatant da u passu 4 è invertite à mischjà.Pone a suluzione in un bagnu di ghiacciu o inserisci in ghiacciu trituratu (o congelatore frigorifero) per 5 min finu à chì a suluzione cambia da torbida à chjara è trasparente (o sempre.ligeramente turbide), è à volte mischjà parechje volte.
Δ Dopu chì l'Endotoxin Scavenger hè aghjuntu à u surnatante, u surnatante diventerà turbide ma uU supernatant deve esse chjaru (o ligeramente turbide) dopu à rinfriscà in u bagnu di ghiaccio.
6. Dopu chì u supernatant hè postu à a temperatura di l'ambienti (> 25 ℃) per 10 - 15 min, diventerà turbide cum'èa so temperatura aumenta à a temperatura di l'ambienti.Allora u supernatante deve esse invertitu per mischjà.
Δ Se a temperatura di l'ambienti hè più bassu o vulete riduce u tempu di estrazione, u supernatant pò esse incubatu in un bagnu d'acqua di 37 ~ 42 ℃ per 5 - 10 min è u prossimu passu pò esse realizatu dopu à u supernatant.diventa torbida.
7. Centrifuge u supernatant à circa 11 000 rpm (12 000 × g) per 10 min à a temperatura di l'ambienti (a temperatura deve esse> 25 ℃) per separà a fase.A fase aquosa superiore cuntene l'ADN, mentre chì a fase oleosa blu inferiore cuntene endotossina è altre impurità.Trasferisce uFase aquosa chì cuntene DNA à un novu tubu èscartà a capa oliu.
Δ A temperatura durante a centrifugazione deve esse più di 25 ℃ cum'è a separazione di fasi efficace ùn hè miccaaccade se a temperatura hè troppu bassu.
Δ Se a separazione di fasi ùn hè micca efficace, a temperatura di centrifugazione pò esse aghjustata à 30 ℃ èu tempu di centrifugazione pò esse aumentatu à 15 min.
Δ Ùn succhiate micca a capa oliosa blu perchè cuntene endotossina è altre impurità.
Meccanismu
Resuspension Lysis Neutralization
◇ Add 7,5 ml Buffer P1
◇ Add 7,5 ml Buffer P2
◇ Add 7,5 ml Buffer P4
Eliminazione di l'endotossina
◇Add 0. 1 volte u voluminu supernatant di Endotoxin Scavenger
Rilegatura e lavaggio
◇ Aghjunghjite 0,5 volte u voluminu di isopropanol
◇ Add 10 ml Buffer PW
◇ Add 10 ml Buffer PW
Eluzione
◇ Add 1 - 2 ml Buffer TB o ddH2O senza Endotoxin
