Plant direct PCR Kit

Cat No: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit hè adattatu per l'amplificazione diretta di foglie di pianta, sementi, etc., è pò esse usatu per screening high-throughput di campioni di pianta chì ùn cuntenenu polisaccaridi è polifenoli.A DNA polimerasi di amplificazione diretta basata nantu à l'evoluzione diretta hà una tolleranza superiore à l'inibitori di PCR in e piante.Intantu, mantene l'alta prestazione di amplificazione, chì hè adattata per l'amplificazione di frammenti di DNA in 5 kb.L'unicu tampone di Lysis A in u kit pò esse usatu per lisà i tessuti vegetali freschi o congelati.Hè faciule d'operà è u lisatu pò esse usatu cum'è mudellu per l'amplificazione senza purificazione.U sistema cuntene agenti protettivi chì permettenu à i campioni crudi di esse amplificati in modu efficace dopu a congelazione è u scongelu ripetuti.2 × Plant Direct Master Mix hà solu bisognu di aghjunghje primers è mudelli per realizà a reazione di amplificazione, riducendu cusì l'operazione di pipetting è migliurà a produzzione di rilevazione è a riproducibilità di i risultati.

Cumpunenti

*Plant Direct Lysis Buffer B hè un reattivu opzionale, chì hè utilizatu per neutralizà u Plant Direct Lysis Buffer A per allargà u tempu di almacenamentu di i campioni.Pò esse usatu secondu a situazione attuale.

Cundizioni di almacenamiento

2 × Plant Direct Master Mix, almacenà à -30 ~ -15 ℃ è evite u congelamentu è u scongelu ripetutu;Plant Direct Lysis Buffer, almacenà à -30 ~ -15 ℃ o 2 ~ 8 ℃.

Prucessu di esperimentu

Prucessu di mostra–Foglia di pianta

Metudu direttu:Hè ricumandemu di utilizà foglie giovani.Aduprate un punch cù un diametru fissu di 0,5 - 3 mm per ottene una mostra chjuca è uniforme, è dopu aghjunghje direttamente a mostra à u sistema PCR (si consiglia un sistema di 50 μl).Nota, assicuratevi chì a mostra hè in a suluzione PCR è micca contru à u muru di u tubu.Se a PCR diretta hè aduprata per amplificà frammenti longu è campioni cumplessi, utilizendu una mostra cù un diametru più chjucu (0,5 - 1 mm) cum'è mudellu pò aiutà à ottene risultati megliu.

Metudu di lisi di macinazione:Hè ricumandemu di utilizà foglie giovani.Pigliate un pezzu di foglia (circa 1 - 3 mm di diametru), mette in 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, è macinate quant'è pussibule (questu passu pò esse fattu sprimendu a foglia cù una punta di pipette 100 μl. per schiacciare u campione).Se u voluminu più grande di tessulu foglia sò utilizati (ùn supera 7 mm), aumenta u voluminu di buffer di diluzione à 50 μl.Dopu chì e foglie sò in terra, a suluzione deve esse verde.Dopu una breve centrifugazione, aghjunghje 1 μl di u supernatante à u sistema PCR cum'è un mudellu di reazionec.

Metodu di lisi termale:Hè ricumandemu di utilizà foglie giovani.Pigliate un pezzu di foglia (circa 1 - 3 mm di diametru), mette in 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, è calore à 95 ° C per 5 - 10 min.U tempu di lisi pò esse allargatu in modu adattatu per e foglie chì sò difficiuli di lisi (micca più di 20 min).Se u voluminu più grande di tessulu foglia sò utilizati (ùn supera 7 mm), aumenta u voluminu di buffer di diluzione à 50 μl.Dopu u riscaldamentu, centrifuga brevemente, è aghjunghje 1 μl di supernatant à u sistema PCR cum'è mudellu di reazioneb.

Prucessu di mostra- Sementi di pianta

Metudu di lisi di macinazione:Aduprate un scalpel per taglià e sementi cù un diametru di 5 mm, aghjunghje à 100 μl di Plant Direct Lysis Buffer A, è macinate a mostra cù una punta di pipette o altri strumenti.Vortex brevemente è lasciate à a temperatura di l'ambienti per 3 - 5 min.Assicuratevi chì a mostra di sementi hè sottumessa in u buffer di diluzione.Dopu una breve centrifugazione, aghjunghje 1 μl di u supernatant à u sistema PCR cum'è mudellu di reazione.

Metodu di lisi termale:Aduprate un scalpel per cutà e sementi cù un diametru di 5 mm, aghjunghje à 100 μl di Plant Direct Lysis Buffer A, è calore à 95 ° C per 5 - 10 min.U tempu di lisi pò esse allargatu in modu adattatu per e foglie chì sò difficiuli di lisi (micca più di 30 min).Dopu u riscaldamentu, centrifugate brevemente, è aghjunghje 1 μl di supernatant à u sistema PCR cum'è un mudellu di reazioneb.

a.Forbici o altri arnesi pò ancu esse usatu per cutà campioni di taglia adattata;se u punch o forbici sò riutilizzati, anu da esse puliti cù una soluzione di ipoclorito di sodiu 2% prima di ogni usu per prevene a contaminazione incruciata trà e mostre.

b.Assicuratevi chì u Plant Direct Lysis Buffer hè cumplettamente fusu prima di l'usu.Se u buffer hè viscosu o hà precipitati, pò esse riscaldatu à 37 ℃ per fondu completamente prima di l'usu.

c.U voluminu di u mudellu in u sistema di reazzione pò esse aghjustatu in modu adattatu secondu a diferenza in u voluminu di materiale vegetale è diluente aghjuntu.

Tampone di lisi diretta di a pianta

U Plant Direct Lysis Buffer A cuntenutu in stu pruduttu hè statu strettamente ottimizatu per liberà u genoma di a maiò parte di i tessuti vegetali è hè adattatu per u almacenamentu di corta durazione di e piante crude à 4 ℃.Se a mostra deve esse guardata per un periudu di tempu più longu (per esempiu, 1 - 2 mesi), hè cunsigliatu di trasferisce u supernatant à un novu tubu EP è almacenà à -20 ℃.Per almacenà i campioni in modu più stabile, aghjunghje un voluminu uguale di Plant Direct Lysis Buffer B à u supernatant trasferitu, mischjà bè è guardate à -20 ℃.U tempu d'almacenamiento stabile varieghja cù campioni di pianta è stati.

Sistema di reazione

a.Contene Mg²⁺à una cuncentrazione finale di 2 mM.

b.Hè cunsigliatu di utilizà una cuncentrazione finale di 0,4 μM per ogni primer.L'usu eccessivu di primers porta à una amplificazione non specifica aumentata.

c.A quantità di mostra utilizata pò esse aghjustata secondu a situazione attuale.A quantità aduprata in una sola reazione di mostra lisata cruda pò esse aghjustata trà 2% - 20% di u voluminu tutale di a reazione.Utilizà troppu campioni pò causà fallimentu di amplificazione.

U prugramma di reazione

a.A Denaturazione Iniziale (98 ℃, 5 min) prumove a lisi di u tissutu vegetale, liberando DNA genomicu chì pò esse usatu per l'amplificazione PCR.Ùn accurtà u tempu o diminuite a temperatura.

b.Il est recommandé de le régler à l'équivalent de la valeur Tm de l'amorce ou de 2 à 4 ℃ plus haut que la valeur Tm.L'ADN polimerasi di amplificazione diretta aduprata in stu pruduttu hè sfarente da a polimerasi di DNA Taq convenzionale, è hà esigenze speciali per a temperatura di annealing di reazione; l'usu di alta temperatura di annealing pò riduce efficacemente l'amplificazione non specifica è migliurà l'efficienza di amplificazione.Per mudelli cumplessi, l'amplificazione efficiente pò esse ottenuta aghjustendu a temperatura di annealing è allargendu u tempu di estensione.

c.Se a durata di u pruduttu di amplificazione hè ≤1 kb, u tempu di estensione hè stabilitu à 30 sec / kb;se a durata di u pruduttu di amplificazione hè> 1 kb, u tempu di estensione hè stabilitu à 60 sec/kb.

d.Per campioni cumplessi o campioni cù un rendimentu di amplificazione bassu, u numeru di ciculi pò esse aumentatu in modu adattatu à 40 -50 ciculi.

Applicazioni

Hè applicabile per l'amplificazione diretta di i tessuti vegetali è u screening high-throughput di campioni di pianta chì ùn cuntenenu polisaccaridi è polifenoli.

Notes

Solu per usu di ricerca.Ùn hè micca usatu in i prucessi di diagnostichi.

1. Per l'amplificazione di a pianta cruda o l'amplificazione diretta, hè cunsigliatu d'utilizà DNA genomicu purificatu cum'è un cuntrollu pusitivu prima di inizià l'esperimentu per assicurà chì u sistema, i primi è l'operazioni sò curretti.

2. L'ADN polimerasi di amplificazione diretta utilizata in questu kit hà una forte attività di correzzione di prova.Se a clonazione TA deve esse realizata, hè cunsigliatu di purificà l'ADN prima di aghjunghje l'adenina.

3. Guida di Design di Primer:

a.Hè ricumandemu chì l'ultima basa à l'estremità 3' di u primer deve esse G o C.

b.Mismatch consecutivi deve esse evitata in l'ultimi 8 basi à l'estremità 3' di u primer.c.Evitate strutture di hairpin à l'estremità 3' di u primer.

d.Differenze in u valore Tm di l'amorce prima è l'amorce inversa ùn deve esse più di 1 ℃ è u valore Tm deve esse aghjustatu à 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 hè cunsigliatu per calculà u valore Tm).

e.Sequences d'amorce supplementari extra chì ùn sò micca cuncordate cù u mudellu, ùn deve micca esse incluse quandu u calculu di u valore Tm di l'amorce.

f.Hè ricumandemu chì u cuntenutu GC di u primer per esse 40% -60%.

g.A distribuzione generale di A, G, C è T in u primer deve esse u più uniforme pussibule.Evite l'usu di e regioni cù un altu cuntenutu di GC o AT.

h.Evitare la presenza di sequenze complementari di 5 o più basi all'interno del primer o tra due primer ed evitare la presenza di sequenze complementari di 3 o più basi all'estremità 3' di due primer.

i.Aduprate a funzione NCBI BLAST per verificà a specificità di u primer per prevene l'amplificazione non specifica.