Proteinasi K (liquide)
Cat No: HC4502A
A Proteinase K hè una serina proteasi stabile cù una larga specificità di sustrato.Degrade assai proteini in u statu nativu ancu in presenza di detergenti.L'evidenza di studii di struttura di cristalli è molekulari indicanu chì l'enzima appartene à a famiglia di subtilisina cù una triade catalitica di u situ attivu (Asp).39- U so69- Ser224).U situ predominante di clivaggio hè u ligame peptide adiacente à u gruppu carboxyl di l'aminoacidi alifatici è aromatichi cù gruppi alfa amino bloccati.Hè cumunimenti usatu per u so larguspecificità.
Specificazione
| Apparizione | Liquidu incolore à marrone chjaru |
| Attività | ≥800 U/ml |
| Cuncentrazione di prutezione | ≥ 20 mg/ml |
| DNase | Nisunu rilevatu |
| RNase | Nisunu rilevatu |
Cundizioni di almacenamiento
Conservate à una temperatura di 2-8 ℃.
Pruprietà
| numeru EC | 3.4.21.64 (Recombinante da Tritirachium album) |
| Pesu moleculare | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Puntu isoelettricu | 7.81 |
| pH ottimale | 7,0-12,0 Fig.1 |
| Temperature ottimali | 65 ℃ Fig.2 |
| stabilità di u pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Fig.3 |
| Stabilità termica | Sottu 50 ℃ (pH 8.0, 30 mins) Fig.4 |
| Attivatori | SDS, urea |
| Inhibitori | diisopropyl fluorophosphate;fluoruro di fenilmetilsulfonil |
Applicazioni
1. Kit di diagnosticu geneticu
2. Kit di estrazione di RNA è DNA
3. Estrazione di cumpunenti non-proteini da tissuti, degradazione di impurità di prutezione, cum'è vaccini di DNA è preparazione di heparin
4. Preparazione di l'ADN cromusomu per l'elettroforesi pulsata
5. Western blot
6. Reagenti enzimatici di l'albumina glycosylated in vitro diagnosi
Precauzioni
Purtate guanti protettivi è occhiali durante l'usu o u pesu, è mantene bè ventilatu dopu l'usu.Stu pruduttu pò causà reazioni allergii di a pelle è irritazione oculare seria.Se inalata, pò causà allergie o sintomi d'asma o dispnea.Pò causà irritazione respiratorie.
Assai
Definizione di unità
Una unità (U) hè definita cum'è a quantità di enzima necessaria per idrolizà a caseina per pruduce 1 μmol di tirosina per minutu in e seguenti cundizioni.
Preparazione di reagenti
Reagent I: 1 g di caseina di latte hè stata dissolta in 50 ml di suluzione di fosfatatu di sodiu 0.1M (pH 8.0), incubata in acqua 65-70 ℃ per 15 minuti, agitata è dissoluta, rinfriscata da l'acqua, aghjustata da l'idrossidu di sodiu à pH 8.0, è fissu. volume 100 ml.
Reagent II: Soluzione TCA: àcitu trichloroacetic 0.1M, acetate di sodiu 0.2M, acid acetic 0.3M.
Reagent III: 0,4 M Na2CO3suluzione.
Reagent IV: Reagent Forint diluitu cù acqua pura per 5 volte.
Reagent V: diluente enzimaticu: suluzione di fosfatatu di sodiu 0.1M (pH 8.0).
Reagent VI: Soluzione di tirosina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml di tirosina dissoluta cù 0,2M HCl.
Prucedura
1. 0.5ml di reagent I hè pre-riscaldatu à 37℃, aghjunghje 0.5ml di suluzione enzyme, mischjà bè, è incubate à 37℃ per 10mins.
2. Aghjunghjite 1ml di reagent II per piantà a reazione, mischjà bè, è cuntinueghja a incubazione per 30mins.
3. Centrifugate suluzione di reazzione.
4. Pigliate 0.5ml supernatant, aghjunghje 2.5ml reagent III, 0.5ml reagent IV, mischjà bè è incubate à 37 ℃ per 30mins.
5. OD660hè statu determinatu cum'è OD1;Gruppu di cuntrollu in biancu: 0.5ml reagent V hè utilizatu per rimpiazzà a suluzione enzimatica per determinà OD660cum'è OD2, ΔOD=OD1- OD2.
6. Curva standard di L-tirosina: 0,5 ml di soluzione di L-tirosina di concentrazione diversa, 2,5 ml di Reagent III, 0,5 ml di Reagent IV in un tubo da centrifuga da 5 ml, incubate a 37 ℃ per 30 minuti, rilevate per OD660per una diversa concentrazione di L-tirosina, allora ottenuta la curva standard Y=kX+b, dove Y è la concentrazione di L-tirosina, X è OD600.
U calculu
2: Volume tutale di suluzione di reazione (mL)
0,5: Volume di suluzione enzimatica (mL)
0.5: Volume liquidu di reazione utilizatu in a determinazione cromogenica (mL)
10: Tempu di reazione (min)
Df: Dilution multiple
C: cuncentrazione di l'enzimi (mg/mL)
Referenze
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Cumunu.(1971);44: 513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56: 103-108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
I figuri
Fig. 1 Ottimu pH
Soluzione tampone 100mM: pH 6.0-8.0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9.0-12.5, Glycine-NaOH. Concentrazione di l'enzima: 1mg/mL
Fig. 2 Temperature ottimali
Reazione in tampone K-fosfatu 20 mM pH 8,0.Concentrazione enzimatica: 1 mg/mL
Fig. 3 pH Stabilità
25 ℃, 16 h-trattamentu cù suluzione tampone 50mM: pH 4.5-5.5, Acetate;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glycine-NaOH.Concentrazione enzimatica: 1 mg/mL
Fig 4 Thermal stabilità
Trattamentu di 30 minuti cù tampone Tris-HCl 50 mM, pH 8,0.Concentrazione enzimatica: 1 mg/mL
Fig 5 Storage stability at 25 ℃
