Uracil DNA Glicosilasi
Uracil-DNA Glycosylase (UNG o UDG) hè un clone recombinante di E.coli cù un pesu moleculare di 25 kDa.Catalyzes a liberazione di l'uracile liberu da u DNA monofilamentu è doppiu chì cuntene uracile, è hè inattivu contr'à RNA, è pò esse usatu per prevene a contaminazione di i prudutti di amplificazione PCR.U principiu di l'azzione hè basatu annantu à u fattu chì, se dUTP hè sustituitu per dTTP in a reazione PCR è si forma un pruduttu di amplificazione PCR chì cuntene basi dU, l'enzima pò rompe selettivamente u legame glycosidic di basi U in una sola fila è a doppia fila. DNA è degrada u pruduttu di amplificazione PCR.
Applicazione cunsigliata
Amplificazione di a prevenzione di a contaminazione
Cundizione di almacenamiento
-20 ° C per u almacenamentu à longu andà, deve esse mischju bè prima di l'usu, evitendu friquenti-discongeli.
Buffer di almacenamentu
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilizzante, 50% Glicerol.
Definizione di unità
La quantità di enzima necessaria per degradare 1 µg di DNA a filamento singolo contenente basi dU in 1 ora a 37 °C è di 1 unità.
Controlu di qualità
1.Purezza elettroforetica SDS-PAGE superiore a 98%
2.Sensibilità di amplificazione, cuntrollu batch-to-batch, stabilità
3.Dopu chì 1U di UNG hè trattatu à 50 ℃ per 2 minuti, u mudellu chì cuntene U sottu à 103 copie deve esse degradatu cumplettamente è ùn pò micca produttu un pruduttu di amplificazione.
4.Nisuna attività nucleasi esogena
Istruzzioni
| Cumpunenti | Volume (μL) | Concentrazione finale |
| 10 × PCR Buffer (senza dNTP, Mg²+gratis) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (sustituisci dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mm |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Primer Mixa | 2 | 1× |
| Template | - | ＜1 μg/reazzione |
| ddH₂O | À 50 | - |
Nota: a: Se usata per qPCR/qRT-PCR, a sonda fluorescente deve esse aghjuntu à u sistema di reazione.Di solitu, una cuncentrazione di primer finali di 0,2 μM pò dà boni risultati;quandu u funziunamentu di reazzione hè poviru, a cuncintrazione di primer pò esse aghjustatu in a gamma di 0,2-1 μM.Di solitu, a cuncentrazione di a sonda hè ottimisata in a gamma di 0,1-0,3 μM.Esperimenti di gradiente di cuncentrazione ponu esse realizati per truvà a megliu cumminazione di primer è sonda.
Notes
1.L'enzima UNG pò esse usata per caccià i prudutti di amplificazione dUTP contaminati da u sistema di reazzione prima di a reazzione di amplificazione PCR, dopu per evità risultati falsi pusitivi per via di a contaminazione di u produttu.
2.A temperatura ottima per l'enzima UNG per esse aduprata in a reazione PCR anti-contaminazione hè generalmente 50 ℃ per 2 minuti;a cundizione di inattivazione hè 95 ℃ per 5 minuti.
3.Evite friquenti-discongeli, è ùn espone micca à grandi fluttuazioni di temperatura.
4.Diversi geni per esse amplificati anu una diversa efficienza d'utilizazione di dUTP è sensibilità à l'enzima UNG, per quessa, se l'usu di u sistema UNG porta à una diminuzione di a sensibilità di rilevazione, u sistema di reazione deve esse aghjustatu è ottimizzatu, se avete bisognu di supportu tecnicu, per piacè cuntattate. a nostra cumpagnia.
