2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Cat No: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) hè pensatu per eseguisce PCR direttamente da campioni senza estrazione di DNA o preparazione di campioni.Stu reagente hè custituitu da DNA polimerasi hot-start, uracile DNA glicosilasi (UNG), RNase Inhibitor, MgCl2, dNTPs (cù dUTP invece di dTTP), è stabilizatori, per a PCR quantitativa (qPCR).Stu reattivu preforma una alta tolleranza à l'inibitore, è cusì pò esse direttamente applicatu à a rilevazione di campioni cum'è tampone di gola, saliva, sangue interu anticoagulatu, plasma è serum senza estrazione di DNA.U reattivu usa un buffer patentatu per qPCR cù enzimi misti di DNA polimerasi anti-inibitori è enzimi UNG.Dunque, pò ottene una bona amplificazione di i geni di destinazione in campioni chì cuntenenu inhibitori è inibisce l'amplificazione falsa positiva causata da a contaminazione residuale è aerosol PCR.Stu reagentu hè cumpatibile cù a maiò parte di strumenti PCR quantitativi fluorescenti, cum'è Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche è cusì.
Cumpunenti
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Cundizioni di almacenamiento
Tutti i cumpunenti deve esse mantinuti à -20 ℃ per un almacenamentu longu è 4 ℃ finu à 3 mesi.Per piacè mischjà bè dopu a scongelu è centrifuga prima di aduprà.Evite friquenti-discongeli frequenti.
Protocolu di ciclismu
| Passu | Temperature | U tempu | Ciclu |
| Digestioni | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Attivazione di polimerasi | 95 ℃ | 1-5 min | 1 |
| Denature | 95 ℃ | 10-20 s | 40-50 |
| Ricottura / Estensione | 56-64 ℃ | 20-60 anni |
Istruzioni per pipettare
| Reagente | Volume per reazione | Volume per reazione | Concentrazione finale |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0,5 µL | 1 µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix1, 2 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Campione3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Volume tutale | 25 μl | 50 μl | - |
1. A cuncentrazione finali di primer hè di solitu 0.2μM.Per megliu risultati, a cuncentrazione di primer pò esse ottimizzata in a gamma di 0.2-1μM.
2. In generale, a cuncentrazione di a sonda pò esse ottimisata in a gamma di 0.1-0.3μM.A cuncentrazione ottimale di a sonda hè ligata à u strumentu di amplificazione PCR in tempu reale, u tipu di sonda è u tipu di sustanza di etichettatura fluorescente.Per piacè riferite à u manuale di l'instrumentu o à i requisiti specifichi di ogni sonda fluorescente.
3. Diversi tipi di campioni cuntenenu diversi tipi è cuntenutu di l'inhibitore è u numeru di copia di u genu di destinazione.U voluminu di mostra deve esse cunsideratu da a cundizione attuale.Fate una diluzione di a mostra aghjunghjendu acqua senza nucleasi o buffer TE, se ne necessariu.
4. Vulume ricumandatu di diversi campioni:
| Campione | Volume per unu 50 μL reazione | Massimu ratio |
| Sangue tutale anticoagulatu | 2,5 μl | 5% |
| Plasma | 15 μl | 30% |
| Serum | 10 μl | 20% |
| tampone di gola | 10 μl | 20% |
| Saliva | 10 μl | 20% |
Controlu di qualità
1. Function detection: sensibilità, specificità è ripetibilità di qPCR.
2. Nisuna attività di nuclease exogenous: senza endonuclease esogenu è contaminazione exonuclease.
Note di u produttu
1. Stu pruduttu impiega un novu tipu di DNA polimerasi hot-start, chì pò esse attivatu in 1-5 minutes.Since u so buffer di reazione hè stata ottimizzata, hè più adattatu per a PCR quantitativa di fluorescenza doppia o multipla cù u metudu di sonda.
2. Se u valore Rn di l'amplificazione PCR hè troppu bassu o l'amplificazione hè ovviamente inibita, diminuendu a quantità di mostra, aumentendu u voluminu di reazione o diluzione previa di a mostra pò migliurà i risultati.
3. A cullizzioni di sangue, saliva, urina, swab di gola, etc. deve seguità i criterii clinichi, è a mostra fresca pò esse usata per prevene a degradazione di l'acidu nucleicu.
4. Siccomu i diversi ampliconi anu una efficienza d'utilizazione diversa à u dUTP è a sensibilità à l'UNG, i reagenti deve esse ottimisati se a sensibilità di deteczione diminuite quandu si usa u sistema UNG.Per piacè cuntattateci per supportu tecnicu se necessariu.
5. Per evitari l'amplificazione di i prudutti di PCR di trasportu trà e reazzioni in un passu, l'area sperimentale dedicata è a pipetta sò necessarie per l'amplificazione.Operate cù guanti è cambiate spessu è ùn apre u tubu di reazione dopu l'amplificazione PCR.
