Trascrittasi inversa M-MLV
RevScript Reverse transcriptase hè ottenuta da a tecnulugia di l'ingegneria genetica.Hà una capacità di sintesi di cDNA più altu, stabilità termale è limite di temperatura di reazione (finu à 60 ° C).U pruduttu cDNA sintetizatu hè finu à 10 kb.Aumenta l'affinità di i mudelli è hè adattatu per a trascrizione inversa di mudelli di RNA cù una struttura secundaria cumplessa o geni di copia bassa.
Cumpunenti
| Cumpunente | HC2003B (10.000 U) | HC2003B (5*10.000U) | HC2003B (200.000 U) |
| Trascrittasi inversa RevScript (200U/μL) | 50 μl | 5 × 50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μl | 1,25 ml | 5 ml |
Cundizione di almacenamiento
Stu pruduttu deve esse guardatu à -25 ° C ~ -15 ° C per 2 anni.
Definizione di unità
Una unità incorpora 1 nmol di dTTP in materiale insolubile à l'acidu in 10 minuti à 37 ° C cù Oligo (dT) cum'è primers.
Configurazione di a reazione
1.Denaturazione di u mudellu di RNA (Questu passu hè facultativu, a denaturazione di u mudellu di RNA aiuta à apre e strutture secondarie, chì migliurà u rendiment di u primu filu cDNA).
| Cumpunenti | Volume (μL) |
| DdH senza RNasi2O | À 13 |
| Oligo (dT)18 (50 μmol/L) ou Random Primer (50 μmol/L) Ou des amorces spécifiques à un gène (2 μmol/L) | 1 |
| o 1 | |
| o 1 | |
| mudellu RNA | X a |
Note:
1) a: RNA totale: 1-5 ug o mRNA: 1-500 ng
2) Incubing à 65 ° C per 5 minuti, poi trasferendu nantu à u ghjacciu subitu per rinfriscà per 2 minuti.Breve centrifugazione per cullà u liquidu di reazione, aghjunghje a suluzione di reazione di trascrizzione inversa cum'è mostra in a tabella seguente.Pipette delicatamente per mischjà.
1.Preparazione di a mistura di reazzione (20 μL di volume)
| Cumpunenti | Volume (μL) |
| Mistura di u passu precedente | 13 |
| 5 × Buffer | 4 |
| dNTP Mix (10 nmol/L) | 1 |
| Trascrittasi inversa (200 U/μL) | 1 |
| Inibitore di RNasi (40 U/μL) | 1 |
1.Eseguite a reazione in e seguenti cundizioni:
| Température (°C) | U tempu |
| 25 °Ca | 5 minuti |
| 42 °Cb | 15-30 minuti |
| 85 °Cc | 5 minuti |
Note:
1) a.L'incubazione à 25 ° C per 5 minuti hè necessaria solu per l'usu di l'esameri casuali.Per piacè saltate stu passu quandu utilizate Oligo (dT)18o Gene Specific Primer.
2) b.A temperatura di trascrizzione inversa cunsigliata hè di 42 ° C, Per mudelli cù strutture secundari complicate o altu cuntenutu di GC, hè cunsigliatu di elevà a temperatura di reazione à 50-55 ° C.
3) c.Riscaldamentu à 85 ° C per 5 minuti per inattivà a transcriptase inversa.
4) U pruduttu pò esse direttamente utilizatu in reazzioni PCR o qPCR, o almacenatu à -20 ° C per u almacenamentu di corta durazione.Hè ricumandemu per aliguot i prudutti è almacenà à -80 ° C per un almacenamentu longu.Evite friquenti-discongeli frequenti.
5) U pruduttu hè adattatu per RT-qPCR in un passu, hè cunsigliatu di aghjunghje 10-20 U transcriptase inversa per ogni sistema di reazione 25μL, o aumentà gradualmente a quantità di transcriptase inversa secondu a situazione attuale.
Notes
1.Per piacè mantene a zona sperimentale pulita;Guanti puliti è maschere deve esse purtati durante l'operazione.Tutti i consumables utilizati in l'esperimentu duveranu esse RNase liberi per prevene a contaminazione da RNase.
2.Tutte e prucedure deve esse realizatu nantu à u ghjacciu per prevene a degradazione di l'RNA.
3.I campioni di RNA di alta qualità sò cunsigliati per assicurà una alta efficienza di a trascrizione inversa.
4.Stu pruduttu hè solu per usu di ricerca.
5.Per piacè operate cù camice di laboratoriu è guanti dispunibuli, per a vostra sicurità.
