Proteinasi K mNGS (liquidu)
A Proteinase K hè una serina proteasi stabile cù una larga specificità di sustrato.Degrade assai proteini in u statu nativu ancu in presenza di detergenti.L'evidenza di studii di struttura di cristalli è molekulari indicanu chì l'enzima appartene à a famiglia di subtilisina cù una triade catalitica di u situ attivu (Asp).39- U so69- Ser224).U situ predominante di clivaggio hè u ligame peptide adiacente à u gruppu carboxyl di l'aminoacidi alifatici è aromatichi cù gruppi alfa amino bloccati.Hè comunmente utilizatu per a so larga specificità.Questa proteinasi K hè apposta per mNGS.In cunfrontu cù l'altra proteinasi K, cuntene ancu menu contaminazione di l'acidu nucleicu cù a stessa prestazione enzimatica, chì puderia assicurà megliu l'applicazione mNGS downstream.
Cundizioni di almacenamiento
2-8 ℃ per 2 anni
Specificazione
| Apparizione | Liquidu incolore à marrone chjaru |
| Attività | ≥800 U/ml |
| Cuncentrazione di Proteina | ≥ 20 mg/ml |
| Nickase | Nisunu rilevatu |
| DNase | Nisunu rilevatu |
| RNase | Nisunu rilevatu |
Pruprietà
| numeru EC | 3.4.21.64(Recombinant de l'album Tritirachium) |
| Puntu isoelettricu | 7.81 |
| pH ottimale | 7.0- 12.0 Fig. 1 |
| Temperature ottimali | 65 ℃ Fig. 2 |
| stabilità di u pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Stabilità termica | Sottu 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig |
| Stabilità di almacenamiento | Più di 90% di attività per 12 mesi à 25 ℃ |
| Attivatori | SDS, urea |
| Inhibitori | diisopropyl fluorophosphate;fluoruro di fenilmetilsulfonil |
Applicazioni
1. Kit di diagnosticu geneticu
2. Kit di estrazione di RNA è DNA
3. Estrazione di cumpunenti non-proteini da tissuti, degradazione di impurità di prutezione, cum'è DNAvaccini è preparazione di heparin
4. Preparazione di l'ADN cromusomu per l'elettroforesi pulsata
5. Western blot
6. Reagenti enzimatici di l'albumina glycosylated in vitro diagnosi
Precauzioni
Purtate guanti protettivi è occhiali durante l'usu o u pesu, è mantene bè ventilatu dopu l'usu.Stu pruduttu pò causà reazioni allergii di a pelle è irritazione oculare seria.Se inalata, pò causà allergie o sintomi d'asma o dispnea.Pò causà irritazione respiratorie.
Definizione di unità
Una unità (U) hè definita cum'è a quantità di enzima necessaria per idrolizà a caseina per pruduce 1 μmoltirosina per minutu in i seguenti cundizioni.
Preparazione di reagenti
Reagent I: 1 g di caseina di latte hè stata dissolta in 50 ml di soluzione di fosfatatu di sodiu 0.1M (pH 8.0), incubata in acqua 65-70 ℃ per 15 minuti, agitata è dissoluta, rinfriscata da l'acqua, aghjustata da l'idrossidu di sodiu à pH 8.0, è u voluminu fissu. 100 ml.
Reagent II: 0.1M àcitu tricloroaceticu, 0.2M acetate di sodiu, 0.3M àcitu acìticu.
Reagent III: 0,4 M Na2CO3suluzione.
Reagent IV: Reagent Forint diluitu cù acqua pura per 5 volte.
Reagent V: diluente enzimaticu: suluzione di fosfatatu di sodiu 0.1M (pH 8.0).
Reagent VI: soluzione di tirosina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml di tirosina dissoluta cù 0,2M HCl.
Prucedura
1. 0,5 ml di reagent I hè pre-riscaldatu à 37 ℃, aghjunghje 0,5 ml di suluzione enzimatica, mischjà bè, è incubate à37 ℃ per 10 minuti.
2. Aghjunghjite 1ml di reagent II per piantà a reazione, mischjà bè, è cuntinueghja a incubazione per 30mins.
3. Centrifugate suluzione di reazzione.
4. Pigliate 0.5ml supernatant, aghjunghje 2.5ml reagent III, 0.5ml reagent IV, mischjà bè è incubate à 37 ℃per 30 minuti.
5. OD660hè statu determinatu cum'è OD1;Gruppu di cuntrollu in biancu: 0.5ml reagent V hè utilizatu per rimpiazzà l'enzimasuluzione per determinà OD660cum'è OD2, ΔOD=OD1- OD2.
6. Curva standard di L-tirosina: 0,5 ml di soluzione di L-tirosina di concentrazione diversa, 2,5 ml di Reagent III, 0,5 ml di Reagent IV in un tubo da centrifuga da 5 ml, incubate a 37 ℃ per 30 minuti, rilevate per OD660per una diversa concentrazione di L-tirosina, allora ottenuta la curva standard Y=kX+b, dove Y è la concentrazione di L-tirosina, X è OD600.
U calculu
2: Volume tutale di suluzione di reazione (mL)
0,5: Volume di suluzione enzimatica (mL)
0.5: Volume liquidu di reazione utilizatu in a determinazione cromogenica (mL)
10: Tempu di reazione (min)
Df: Dilution multiple
C: cuncentrazione di l'enzimi (mg/mL)
Referenze
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Cumunu.(1971);44: 513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56: 103-108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
I figuri
Fig.1 Ottimu pH
Soluzione tampone 100mM: pH 6.0-8.0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9.0-12.5, Glycine-NaOH. Concentrazione di l'enzima: 1mg/mL
Fig.2 Temperature ottima
Reazione in tampone K-fosfatu 20 mM pH 8,0.Cuncentrazione di l'enzima: 1 mg/mL
Fig.3 pH Stabilità
25 ℃, 16 h-trattamentu cù suluzione tampone 50 mM: pH 4.5- 5.5, Acetate;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glycine-NaOH.Cuncentrazione di l'enzima: 1 mg/mL
Fig.4 Thermal stabilità
Trattamentu di 30 minuti cù tampone Tris-HCl 50 mM, pH 8,0.Cuncentrazione di l'enzima: 1 mg/mL
Fig.5 Storage stability at 25 ℃
