Trascrittasi inversa RTL
La transcriptasi inversa RTL è una DNA polimerasi dipendente dal modello di RNA che manca di attività esonucleasi 3'→5' e ha attività RNasi H.Questa enzima pò aduprà RNA cum'è mudellu per sintetizà un filu cumplementariu di DNA, chì pò esse appiicatu à a sintesi di cDNA di u primu filu, in particulare per RT-LAMP (amplificazione isotermica mediata da loop).Comparatu cù a transcriptase inversa RTL 1.0, a sensibilità hè significativamente mejorata, a stabilità termale hè più forte, è a reazione à 65 ° C hè più stabile.RTL reverse transcriptase (glicerol free) pò esse usata per preparà preparati liofilizzati, reagenti RT-LAMP liofilizzati, ecc.
Definizione di unità
Una unità incorpora 1 nmol di dTTP in materiale precipitabile à l'acidu in 20 minuti à 50 ° C usendu poly(A)•oligo(dT)25 cum'è template-primer.
Cumpunenti
| Cumpunente | HC 5008A-01 | HC 5008A-02 | HC 5008A-03 |
| RTL trascrittasi inversa (senza glicerolo) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10 × HC RTL Buffer | 1,5 ml | 4 × 1,5 ml | 5 × 10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3 × 10 ml |
Cundizione di almacenamiento
U trasportu sottu 0 ° C è esse guardatu à -25 ° C ~ -15 ° C.
Controlu di qualità
- Attività residuale diEndonucleasi:Una reazione di 50 μL chì cuntene 1 μg di λDNA è 15 unità di RTL2.0 incubate per 16 ore à 37 ℃ mostra u stessu mudellu di cuntrollu negativu per elettroforesi di gel.
- Attività residuale diEsonucleasi:Una reazione di 50 μL contenente 1 μg di λDNA digerito Hind Ⅲ è 15 unità di RTL2.0 incubate per 16 ore à 37 ℃ mostra u stessu mudellu di cuntrollu negativu per elettroforesi di gel.
- Attività residuale diNickase:Una reazione di 50 μL chì cuntene 1 μg di pBR322 supercoiled è 15 unità di RTL2.0 incubate per 4 ore à 37 ° C mostra u stessu mudellu di cuntrollu negativu per elettroforesi di gel.
- Attività residuale diRNase:Una reazione di 10 μL chì cuntene 0,48 μg di MS2 RNA è 15 unità di RTL2.0 incubate per 4 ore à 37 ° C mostra u stessu mudellu di cuntrollu negativu per elettroforesi di gel.
- E. coli gDNA:Misuratu cùE.colikits di rilevazione HCD specifichi, 15 unità di RTL2.0 cuntene menu di 1E. coligenoma.
Configurazione di a reazione
Protocolu di sintesi di cDNA
| Cumpunenti | Volume |
| Template RNA a | facultativu |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) o Random Primer mix (60uM) | 2 μl |
| dNTP Mix (10 mM ognunu) | 1 μl |
| Inibitore di RNasi (40U/uL) | 0,5 μL |
| Trascrittasi inversa RTL 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10 × HC RTL Buffer | 2 μl |
| Acqua senza nucleasi | Finu à 20 μL |
Note:
1) La dose consigliata di RNA totale è 1ng~1μg
2) A dosa raccomandata di mRNA era 50ng ~ 100ng
Termu-Ciclismo Condizioni per una rutina reazione:
| Température (°C) | U tempu |
| 25 °Ca | 5 minuti |
| 55 °C | 10 minutib |
| 80 °C | 10 minuti |
Note:
1) Se si usa Random Primer Mix, una fase di incubazione à 25 ° C.
2) Se si usa una mistura di primer target, un passu di incubazione à 55 ° C per 10 ~ 30 minuti.
Protocolu RT-LAMP
| Cumpunenti | Volume | Concentrazione finale |
| Template RNA | facultativu | ≥10 copie |
| dNTP Mix (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mm |
| Primer FIP/BIP (25×) | 1 μl | 1,6 μM |
| Primer F3/B3 (25×) | 1 μl | 0,2 μM |
| Primers LoopF/LoopB (25×) | 1 μl | 0,4 μM |
| Inibitore di RNasi (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reazione |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U/Reazione |
| DNA polimerasi Bst V2 (8U/μL) | 1 μl | 8 U/Reazione |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μl | 6 mM (Totale 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (o 10×HC Bst V2 Buffer) | 2,5 μl | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Acqua senza nucleasi | Finu à 25 μL | - |
Note:
1) Mesturà in vortexing è centrifuga brevemente per cullà.Incubazione à temperatura constante à 65 ° C per 1 ora.
2) I dui buffers sò interoperabili è anu a listessa cumpusizioni.
Notes
1.Stu pruduttu formarà un solidu biancu quandu si guarda à -20 °C.Pigliate da -20 ° C è mette nantu à u ghjacciu per circa 10 minuti.Dopu à u funnu, pò esse usatu da scuzzulate è mischjendu.
2.U pruduttu cDNA puderia esse guardatu à -20 ° C o -80 ° C o utilizatu immediatamente per a reazzione PCR.
3.Per prevene a contaminazione da RNase, mantene a zona spirimintali pulita, è porta guanti è maschere puliti durante l'operazione.
