Proteinase K NGS (polvere)
Cat No: HC4507A
NGS Protease K hè una serina proteasi stabile cù una alta attività enzimatica è una larga specificità di sustrato. L'enzima decompone preferenzialmente i legami ester è i legami peptidici adiacenti à a C-terminale di aminoacidi idrofobici, aminoacidi chì cuntenenu zolfo è aminoacidi aromatici.Dunque, hè spessu usatu per degradà e proteine in peptidi brevi.NGS Protease K hè una serina proteasi tipica cù l'Asp39- U so69- Ser224triade catalitica chì hè unica per i proteasi di serina, è u centru cataliticu hè circundatu da u tow Ca2+siti di ubligatoriu per a stabilizazione, mantenendu una alta attività enzimatica in una gamma più larga di cundizioni.
Specificazione
| Apparizione | Polvere amorfa bianca a biancastra, liofilizzata |
| Attività specifica | ≥40U/mg solidu |
| DNase | Nisunu rilevatu |
| RNase | Nisunu rilevatu |
| Bioburden | ≤50 CFU/g solide |
| Residu di l'acidu nucleicu | <5 pg/mg solidu |
Pruprietà
| Fonte | Tritirachium album |
| numeru EC | 3.4.21.64(Recombinant de l'album Tritirachium) |
| Pesu moleculare | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Puntu isoelettricu | 7,81 Fig.1 |
| pH ottimale | 7.0-12.0 (Tutti facenu attività alta) Fig.2 |
| Temperature ottimali | 65 ℃ Fig.3 |
| Stabilità di pH | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) Fig.4 |
| Stabilità termica | Sottu 50℃ (pH 8,0, 30min) Fig.5 |
| Stabilità di almacenamiento | Conservatu à 25 ℃ per 12 mesi Fig.6 |
| Attivatori | SDS, urea |
| Inhibitori | diisopropyl fluorophosphate;benzilsulfonil fluoruru |
Cundizioni di almacenamiento
Guardà u polveru liofilizatu à -25 ~ -15 ℃ per un bellu pezzu luntanu da a luce;Dopu a dissoluzione, l'aliquota in u voluminu adattatu per u almacenamentu à breve termine à 2-8 ℃ luntanu da a luce o un almacenamentu longu à -25 ~ -15 ℃ luntanu da a luce.
Precauzioni
Purtate guanti protettivi è occhiali durante l'usu o u pesu, è mantene bè ventilatu dopu l'usu.Stu pruduttu pò causà reazioni allergii di a pelle è irritazione oculare seria.Se inalata, pò causà allergie o sintomi d'asma o dispnea.Pò causà irritazione respiratorie.
Definizione di unità
Una unità di NGS Protease K hè definita cum'è a quantità di enzima necessaria per idrolizà a caseina in 1 μmol L-tirosina in cundizioni standard di determinazione.
Preparazione di reagenti
| Reagente | U fabricatore | Catalogu |
| Caseina tecnicada u latti bovinu | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4· 2 ore2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| L'acidu tricloroaceticu | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Acetate di sodiu | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| L'acidu acìticu | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Carbonate di sodiu | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Foline-phenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirosina | Sigma | 93829 |
Reagent I:
Substratu: 1% Caseina da suluzione di latte bovinu: dissolve 1g di caseina di latte bovino in 50ml di soluzione di fosfatatu di sodiu 0.1M, pH 8.0, calore in bagnu d'acqua à 65-70 ° C per 15 minuti, agitate è dissolve, rinfriscà cù acqua, aghjustatu da l'idrossidu di sodiu à pH 8,0, è diluce in 100 ml.
Reagent II:
Soluzione TCA: 0.1M àcitu trichloroacetic, 0.2M acetate di sodiu è 0.3M àcitu acìticu (pesu 1.64g àcitu trichloroacetic + 1.64g acetate di sodium + 1.724mL àcitu acìticu successivamente, aghjunghje 50mL acqua deionized, è aghjustà cù diHCl3 à pH 4.0). 100 ml).
Reagent III:
Soluzione di carbonate di sodiu 0,4 m (pesa 4,24 g di carbonate di sodiu anidru è dissolve in 100 ml d'acqua)
Reagent IV:
Folin phenol reagent: dilute 5 volte cù acqua deionizzata.
Reagent V:
Diluente enzimaticu: soluzione di fosfatatu di sodiu 0,1 M, pH 8,0.
Reagent VI:
Soluzione standard di L-tirosina: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml L-tirosina dissoluta cù 0.2M HCl.
Prucedura
1. Accende u spettrofotometru UV-Vis è selezziunate a misura fotometrica.
2. Stallà a lunghezza d'onda cum'è 660nm.
3. Accende u bagnu d'acqua, stabilisce a temperatura à 37 ℃, assicuratevi chì a temperatura ùn cambia per 3-5 minuti.
4. Preheat 0.5mL sustrato in un tubu di centrifuga 2mL à 37℃ bagnu d'acqua per 10mins.
5. Extract 0.5mL diluted enzyme solution in u tubu di centrifuga preheated per 10 minuti.Pone u diluente enzimaticu cum'è un gruppu biancu.
6. Aghjunghjite 1.0 mL reagent TCA immediatamente dopu a reazione.Imbulighjate bè è incubate in bagnu d'acqua per 30 minuti.
7. Centrifugate a suluzione di reazzione.
8. Aghjunghjite i seguenti cumpunenti in l'ordine specificatu.
| Reagente | Volume |
| Supernatant | 0,5 ml |
| 0,4 M di carbonate di sodiu | 2,5 ml |
| Folin reagente fenol | 0,5 ml |
9. Imbulighjate bè prima di incubating in bagnu d'acqua à 37 ℃ per 30 minuti.
10. OD660hè statu determinatu cum'è OD1;Gruppu di cuntrollu in biancu: U diluente enzimaticu hè adupratu per rimpiazzà a suluzione enzimatica per determinà l'OD660cum'è OD2, ΔOD=OD1- OD2.
11. Curva standard di L-tirosina: 0,5 mL di soluzione di L-tirosina di concentrazione diversa, 2,5 mL 0,4 M di carbonato di sodio, 0,5 mL di reattivo fenolo Folin in un tubo da centrifuga da 5 mL, incubate a 37 ℃ per 30 minuti, rilevate per OD660per una diversa concentrazione di L-tirosina, allora ottenuta la curva standard Y=kX+b, dove Y è la concentrazione di L-tirosina, X è OD600.
U calculu
2: Volume tutale di suluzione di reazione (mL)
0,5: Volume di suluzione enzimatica (mL)
0.5: Volume liquidu di reazione utilizatu in a determinazione cromogenica (mL)
10: Tempu di reazione (min)
Df: Dilution multiple
C: cuncentrazione di l'enzimi (mg/mL)
I figuri
Fig.1 Residu di DNA
| Campione | Ave C4 | Acidu Nucleicu Recuperazione (pg/mg) | Recuperazione (%) | Nucleicu tutale acidu ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK + STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| H2O senza RNA | Indeterminatu | — | — | — |
Fig.2 pH ottimali
Fig.3 Temperature ottimali
Fig.4 Stabilità di u pH
Fig.5 Stabilità termale
Fig.6 Stabilità Storage à 25 ℃
